I Medici erano allora ritornati al potere. Inviato un forte esercito nella zona di Arezzo che si era ribellata, suscitarono le paure dei senesi. Siena, che sino ad allora era riuscita a conservare la propria indipendenza, temeva ora di essere annientata. Dato il comando a Piero Strozzi, acerrimo nemico dei Medici, l'esercito senese si diresse subito in Valdichiana. Occupati Lucignano e Chiusi, puntò subito su Marciano, accerchiandolo. Ma i fiorentini avevano munito potentemente la rocca con un presidio di mille fanti. Brillò allora la figura del marcianese Brandino Brandimarte che ebbe il comando del presidio, come ricorda una lapide posta nella piazza principale del paese. Il comandante della piazzaforte Lattanzio Pichi, temendo di essere sopraffatto si arrese allo Strozzi. Poco dopo cadde Foiano. Il Marchese di Marignano, accampato all'assedio di Monte San Savino, si spinse verso Marciano per attaccare lo Strozzi. Un enorme numero di uomini venne a trovarsi tra Marciano e Pozzo. Il 1° agosto del 1554, dopo varie scaramucce, i due schieramenti, in pieno assetto di guerra e forti di decine di migliaia di uomini vennero allo scontro. Le truppe senesi vennero sopraffatte e in parte annientate. Questa grande battaglia del '500 passò alla storia come Battaglia di Marciano, perché la rocca venne ad essere al centro della disposizione tattica.
A ricordo della grande battaglia che annientò definitivamente Siena, Cosimo I ordinò al Bartolomeo Ammanati di edificare un tempio nel luogo della vittoria e una colonna marmorea venne eretta in Firenze, in piazza S. Felice.
Sempre a quegli anni risale la creazione dell'Ordine dei Cavalieri di S. Stefano, di cui venne a far parte la stessa chiesa di Marciano.
Dopo queste mirabili e terribili vicende, Marciano ebbe vita pacifica rimanendo sotto le dipendenze di Firenze sino al 1860. La fedeltà alla città del Giglio fu ripagata col poter apporre sullo stemma comunale lo stesso Giglio di Firenze.